界面组织工程通过重建复杂的、层次分明的界面组织，修复或再生受损的不同组织连接部位，为界面修复和再生带来了新的机遇[1,2]。人体内存在许多界面组织，如软骨-骨、肌腱-骨、半月板-骨和肌肉-肌腱界面，这些界面都具有分级结构，在器官的正常发育和功能中发挥着重要的作用[3]。然而，由于界面组织具有渐进性和高度复杂性特点，此类组织一旦受到损伤，就难以修复。采用传统的单一成分构建的支架缺少梯度过渡分级结构界面特性，不能满足界面组织的基质成分、细胞类型及结构功能的多层性和连续性，致使组织间整合性能较差，容易发生二次损伤[4~6]。因此，开发新的操作简单、绿色无毒且易于构建分级结构的技术，模拟天然界面组织的梯度过渡分级结构，设计并制备具有连续梯度过渡分级结构的一体化界面组织仿生支架是新一代界面组织工程研究的目标。骨与肌腱/韧带界面区域的再生一直是界面组织工程关注的热点之一。此界面区域在运动过程的实现发挥重要的作用，尤其是实现骨与肌腱/韧带之间力学载荷的有效传递[7,8]。临床上，针对肌腱-骨连接点损伤进行外科手术后，腱-骨界面层组织难以恢复，临床效果不理想，严重影响患者后续的日常生活[9,10]。由此可见，设计并制备具有梯度过渡分级结构的仿生肌腱-骨支架在界面组织工程中具有极大的应用前景。在以往的研究中，多采用仿生学策略来实现骨与移植物之间生物功能性的整合,通过各种方法合成了具有连续梯度结构和性能的梯度材料。例如，Lu等[11]采用烧结方法制备了聚乙丙交酯、PLGA微球层和PLGA/生物活性玻璃三层复合材料，分别对应肌腱层、肌腱与骨的过渡层和骨层。Kim等[12]采用叠层冷冻干燥的方法制备了由胶原层(肌腱层)、胶原与硫酸软骨素交联层(纤维软骨层)、矿化的胶原层(矿化纤维软骨层)和多次矿化胶原层(骨组织层)依次过渡的四层结构组成的仿生肌腱-骨支架。此外，Xia等[13]报道了采用叠层涂层法和激光打孔技术结合的方法，制备了具有可以促进胶原纤维定向沉积的有序通道层、矿化梯度变化层以及大孔多孔结构的羟基磷灰石层三层的肌腱-骨支架。尽管目前所报道的肌腱-骨支架具有过渡层结构(通常由双层、三层或更多层不同结构组成)，但大多采用不同层进行拼装来制备的，且这些拼装的具有过渡层结构的支架因缺乏真正的融合界面过渡层，极易导致层间分层，尤其是当不同层的厚度不一样以及相邻层降解出现差异时会导致界面发生破裂[1,12]，且这些方法制备的材料梯度结构也相对简单。为此，有研究者通过控制高分子材料的交联度，有效减少分层现象。这种方法可分为化学交联法和物理交联法。例如，Ker等[14]采用化学交联，通过控制光照射时间制备具有不同交联度的材料，使材料的力学性能呈现出平滑的梯度变化。然而，化学交联法存在一定的局限性[15]，如引发剂、交联剂等的使用，会导致有毒物质的残留，且不同密度的交联剂沿梯度的表面化学性质不同，形成梯度刚度范围较窄，制造过程复杂等缺点。而物理交联法[16]无需使用对细胞造成毒性的引发剂或影响材料生物活性的交联剂，且制备条件较为简单，在具有分级结构的仿生支架的制备方面显现了巨大的前景。聚乙烯醇(PVA)水凝胶具有较高的含水量、优异的力学性能、溶胀稳定性、无毒性和生物相容性[17~19]，但蛋白质吸附和细胞粘附性较差。众所周知，明胶有高温溶解、低温成胶[20~22]的特点，且具有可以与细胞表面蛋白相互作用的活性和功能位点。因此，将明胶与PVA聚合物混合，有望得到一种兼具两者优点的材料，从而提高材料的整体性能。羟基磷灰石(HAp)[23,24]是人体骨骼组织的主要无机组成成分，是一种理想的骨修复材料，具有良好的生物相容性和生物活性，能够促进骨组织的生长，并诱导其修复。为了防止具有分级结构的多相支架不同层破裂或消除支架制备过程引入具有毒性的化学物质，本研究以PVA和明胶为基质材料，用冻融循环技术[25]结合逐层涂覆技术制备了具有分级结构的仿肌腱-骨界面一体化支架。首先，将含有15% HAp的PVA/明胶混合溶液经过冷冻制备一体化支架的矿化层(以促进支架与骨的整合)，然后采用逐层涂覆含有不同浓度的HAp的PVA/明胶混合溶液并结合冷冻-解冻循环制备梯度矿化层(以促进应力在肌腱和骨之间的转移)，最后加入不含HAp的PVA/明胶混合溶液，通过冷冻制备未矿化层(以促进支架与肌腱的整合)。1实验部分1.1主要原料聚乙烯醇(PVA, M.W. 8.9×104~9.8×104, 99% hydrolyzed)购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司(Sigma-Aldrich)；明胶购自上海阿拉丁试剂有限公司；羟基磷灰石购自上海麦克林生化科技有限公司；硫氰酸钠和尿素均购自西陇科学股份有限公司。以上试剂均为分析纯。1.2具有分级结构的PVA/明胶凝胶支架的制备将PVA粉末加入去离子水中，90 ℃加热溶解，搅拌约3 h，制得10 wt%的PVA水溶液。将其放置在90 ℃下并去除气泡。同时，将明胶粉末加入去离子水中，60 ℃下完全溶解，制得10 wt%的明胶溶液。然后，将PVA溶液与明胶溶液按9:1的体积比混合均匀，得到1%明胶/9% PVA的溶液。用不同量的HAp粉末分别与10 mL去离子水混合，在常温下磁力搅拌3天以上保证HAp分散均匀，制得30%、26%、22%、18%的HAp混合液。随后高温高压下配置浓度为36%的PVA溶液和浓度4%的明胶溶液，取明胶溶液和PVA溶液各5 mL，加入到之前配置好的4种不同浓度的HAp混合液中，得到1%明胶/9% PVA/15% HAp、1%明胶/9% PVA/13% HAp、1%明胶/9% PVA/11% HAp、1%明胶/9% PVA/9% HAp混合溶液，分别标记为溶液A、B、C、D。然后，采用冻融循环技术结合逐层涂覆技术制备具有分级结构的一体化支架。制备过程和原理如图1所示：将700 μL溶液A加入到24孔板中，然后将24孔板先放置在-20 ℃的冰箱中冷冻18 h，再置于室温下解冻6 h。在第一次循环之后，将60 μL溶液B滴到刷子上，然后用刷子均匀涂覆溶液B于A上，继续于-20 ℃冷冻18 h并在室温融化6 h。涂覆溶液C、D的方法同溶液B。最后，在其最上层加入不添加HAp的PVA/明胶溶液置于最上层，重复进行3次冻融循环，最后将得到的PVA/明胶/HAp水凝胶样品放置于冷冻干燥机中，于-60 ℃冷冻10 h，然后再干燥48 h，即可得到具有分级结构的PVA/明胶水凝胶支架。10.14028/j.cnki.1003-3726.2024.23.243.F001图1冻融循环技术结合逐层涂覆技术制备PVA/明胶/HAp水凝胶的流程图Figure 1Schematic illustration of the fabrication of PVA/Gelatin/HAp hydrogel by freezing-thawing and coating method1.3分析与表征1.3.1傅里叶变换红外光谱测试采用布鲁克VECTOR-22型红外光谱测试仪对纯明胶、纯PVA、明胶/PVA混合物进行红外光谱分析。此外，将样品分别浸于5 mol/L的尿素和NaSCN以及去离子水中12 h，并对处理后的样品进行红外光谱分析，未浸泡的样品作为对照。1.3.2力学性能测试移液枪移取不同组分溶液2 mL排放到模具中，制成长度75 mm，宽度4 mm的哑铃型样品。采用万能拉伸试验机(CMT4104型)对制备的哑铃型样品进行力学性能测定。室温下，拉伸速率为70 mm/min。每种样品测试5组，取平均值。1.3.3具有分级结构的PVA/明胶凝胶支架的形貌观察和元素分析使用日立公司的SU8010型扫描电子显微镜(SEM)和X射线能谱(EDS)对制备的水凝胶支架的微观形貌进行观测。分析前对支架进行喷金处理(真空，电流50 mA，喷金时间3 min)。2结果与讨论2.1PVA/明胶凝胶的合成及结构分析PVA/明胶凝胶的宏观拍照图片如图2(a)所示，样品在多次冷冻-解冻循坏后最终形成乳白色的凝胶。这是因为冷冻使溶剂本体或低分子溶质在冻结时产生结晶，从而减少了聚合物链的空间，增加了聚合物的浓度，迫使聚合物链排列并形成水凝胶的网络结构[26]，此法是构筑物理交联凝胶网络最常用的方法。在整个凝胶化过程中，没有引入化学交联剂，PVA/明胶水凝胶是通过可逆的非共价键，即氢键、范德华力相互作用而形成。研究表明，尿素和NaSCN可以破坏由物理交联形成的凝胶中的氢键[27]。10.14028/j.cnki.1003-3726.2024.23.243.F002图2(a)浸于5 mol/L的尿素和NaSCN以及去离子水中12 h后的PVA/明胶水凝胶照片；(b) PVA、明胶和PVA/明胶水凝胶的FTIR谱图；(c)浸于5 mol/L的尿素、NaSCN以及去离子水中12 h后的PVA/明胶水凝胶应力-应变曲线Figure 2(a) Photograph to describe the morphology of PVA/Gelatin hydrogel after soaking into water, urea (5 mol/L), and NaSCN (5 mol/L) solutions for 12 h; (b) FTIR spectra of PVA, Gelatin and PVA/Gelatin hydrogel; (c) Tensile stress-strain curves of PVA/Gelatin hydrogel after soaking into water, urea (5 mol/L), and NaSCN (5 mol/L) solutions for 12 h为此，本研究在室温下，将PVA/明胶水凝胶分别在水、尿素和NaSCN中浸泡处理12 h。结果如图2(a)所示，PVA/明胶水凝胶在尿素和NaSCN溶液中浸泡后，样品变得更加透明，而泡在水中的PVA/明胶水凝胶仍呈现乳白色。此外，分别浸泡在水、尿素和NaSCN溶液中12 h后取出的PVA/明胶水凝胶力学性能与未浸泡的PVA/明胶水凝胶相比，力学性能降低，尤其是在尿素和NaSCN溶液中浸泡后，水凝胶力学性能明显降低(图2c)。由此可见，PVA/明胶水凝胶通过可逆的非共价键，即氢键、范德华力相互作用物理交联而形成。PVA、明胶以及两者混合支架的红外光谱结果如图2(b)所示，明胶的特征基团C＝O吸收峰在1754 cm–1处，在PVA/明胶凝胶支架中对应吸收峰向低波数移动，至1636 cm–1；此外，PVA的红外光谱吸收峰中，C－O基团的吸收峰为1076 cm–1，在PVA/明胶凝胶支架中对应的吸收峰向低波数移动至1049 cm–1。这是因为PVA/明胶凝胶中氢键的形成使得电子云密度降低，化学键的伸缩振动减弱导致的[28]。2.2冻融循环次数对PVA/明胶凝胶力学性能影响分析冷冻-解冻循环次数对PVA/明胶凝胶的影响，结果如图3(a)所示，循环1次，凝胶非常软，且呈透明状，随循环次数增加，样品逐渐变硬，且颜色由透明状向乳白色变化，这是因为随着冻融循环次数增加，凝胶网络形成的氢键增多，结晶度增高，高分子之间联结越紧密，样品逐渐由透明状变成乳白色[29]。10.14028/j.cnki.1003-3726.2024.23.243.F003图3(a)不同冻融循环后PVA/明胶水凝胶的形貌照片；(b~e)不同冻融循环后PVA/明胶水凝胶的拉伸性能分析：(b)应力-应变曲线，(c)拉伸强度，(d)伸长率，(e)杨氏模量Figure 3(a) Photograph to describe the morphology of PVA/Gelatin hydrogel after freezing-thawing at different cycles; (b-e) Tensile properties of PVA/Gelatin hydrogel after freezing-thawing at different cycles: (b) stress-strain curves, (c) tensile strength, (d) elongation at break, (e) Young’s modulus研究表明，增加冷冻-解冻循环次数能显著提升水凝胶的力学性能，且不影响凝胶的生物相容性、可降解性和无毒性[30]。如图3(b)~3(e)所示，随着循环次数的增加，凝胶的力学性能呈现上升趋势，冷冻-解冻次数的增加(1~7次循环)，使得分子间作用力增加，力学强度明显增加(从0.05 MPa到1.85 MPa)。2.3具有分级结构的PVA/明胶凝胶的力学性能分析骨与肌腱/韧带相连接的部位即腱/韧带-骨界面，由结构特性渐变的骨、纤维软骨和肌腱/韧带三层组织构成，其中，独特的梯度渐变结构对于确保骨和软组织之间顺利的机械应力传递尤为重要[31]。为此，本研究通过逐层涂覆方法制备具有矿物成分梯度和力学性能梯度的区域，以促进应力在肌腱和骨之间的转移。首先，研究了羟基磷灰石对凝胶支架力学性能的影响。结果如图4所示，随着HAp的浓度增加，力学性能逐渐增强。HAp的浓度从15%降到9%，应力应变分别从0.35 MPa、127%降到0.043 MPa、51%。HAp粒子的高表面能和比表面，可有效提高HAp粒子同PVA/明胶基体的界面结合强度，有利于改善支架的力学性能[30,32]。从图5结果可见，随HAp的含量以及冷冻-解冻循环次数的增加，水凝胶支架的力学性能也呈现增加趋势。如含有15% HAp且冷冻解冻循环7次的凝胶的力学性能(应力为1.02 MPa，应变为182%)明显强于没有添加HAp冷冻-解冻循环1次的凝胶(应力为0.05 MPa，应变为75%)，因此中间的界面组织部分由于涂覆不同含量的HAp (9%~13%)以及冷冻-解冻循环次数的减小，其力学性能呈现连续梯度递减。此力学性能梯度界面对于分散两个不同组织之间的应力集中，实现肌腱到骨的应力传递具有重要的意义。10.14028/j.cnki.1003-3726.2024.23.243.F004图4在循环3次时，加入不同浓度的羟基磷灰石的PVA/明胶凝胶的拉伸性能分析：(a)应力-应变曲线，(b)拉伸强度，(c)伸长率，(d)杨氏模量Figure 4Tensile properties of PVA/Gelatin hydrogel with different concentrations of hydroxyapatite after freezing-thawing at three cycles: (a) stress-strain curves, (b) tensile strength, (c) elongation at break, (d) Young’s modulus10.14028/j.cnki.1003-3726.2024.23.243.F005图5在不同循环次数下，加入不同浓度的羟基磷灰石的PVA/明胶凝胶的拉伸性能分析：(a)应力-应变曲线，(b)拉伸强度，(c)伸长率，(d)杨氏模量Figure 5Tensile properties of PVA/Gelatin hydrogel with different concentrations of hydroxyapatite after freezing-thawing at different cycles: (a) stress-strain curves, (b) tensile strength, (c) elongation at break, (d) Young’s modulus2.4具有分级结构的PVA/明胶凝胶支架的微观结构分析和元素分析羟基磷灰石是人体骨骼的主要无机组成成分，可通过诱导成骨细胞来促进骨愈合和再生，是目前研究和应用较为广泛的一类骨缺损修复材料[33]。而且，羟基磷灰石的生物相容性极好，易与骨骼形成化学结合键，形成骨性结合[34]。本研究通过冷冻-解冻循环技术结合涂覆的方法制备了具有分级结构的PVA/明胶/HAp凝胶支架。图6(a)为水凝胶仿生支架的截面形貌。上层是由纯1%明胶/9% PVA组成的未矿化层(图6b和6d)，具有典型的多孔结构，而下层为添加羟基磷灰石纳米颗粒的矿化层(图6c和6e)，由于表面存在HAp晶体则表现出较小的孔径，且随着HAp含量的增加，部分HAp粒子在支架中呈团聚状态。由此可知，HAp粒子被成功引入PVA/明胶凝胶支架，且均匀分布在支架中。10.14028/j.cnki.1003-3726.2024.23.243.F006图6(a)分级结构支架过渡层的SEM图；(b，d)分级结构支架含有羟基磷灰石区域在不同倍数下的SEM图和(c，e)分级结构支架不含羟基磷灰石区域在不同倍数下的SEM图Figure 6(a) SEM image of the cross-section of a hierarchical scaffold. SEM images of the areas without hydroxyapatite (b, d) and with hydroxyapatite (c, e) of a hierarchical scaffold in different magnifications能谱分析(EDS)结果如图7(a)~7(c)所示，钙和碳的含量呈梯度变化。从上层到下层，钙含量逐渐增多，而碳含量则相反。通过将界面划分为5个小部分，进一步量化这种分级变化，结果如图7(d)所示，Ca/(C+Ca)的比值从下层的约57%逐渐下降到上层的0%。由此可见，该支架从上到下，矿物质含量从无到有，且含量逐渐增多，具有矿物梯度结构。10.14028/j.cnki.1003-3726.2024.23.243.F007图7在分级结构支架过渡层的元素分布的EDS映射：钙(a)，碳(b)和钙+碳(c)的梯度分布；(d)钙含量沿垂直方向量化，其中X轴表示矿物含量最高的位置的距离Figure 7EDS mapping of elemental distributions recorded from the cross-section of a graded PVA/Gelatin/HAp scaffold: (a–c) graded distributions of calcium (a), carbon (b), and calcium + carbon (c); (d) Quantification of calcium content along the vertical direction (n = 3), where the X axis indicates the distance from the location with the highest mineral content3结论本文采用冷冻-解冻循环技术结合涂覆技术，并通过控制涂覆溶液中HAp的含量制备了由未矿化的区域、具有矿物成分梯度和力学性能梯度的区域和具有较高力学性能的矿化区域三部分组成的一体化水凝胶仿生肌腱-骨支架。该支架具有类天然界面组织分级过渡界面结构，在促进腱-骨界面损伤修复领域具有重要的应用前景。此外，本研究为具有分级结构一体化仿生支架的构建提供了新思路，在界面组织工程中具有极大的应用前景。